TÈCNIQUES DE CULTIU I IDENTIFICACIÓ
DELS VIRUS
Les tècniques de cultiu no es poden realitzar en medis com els dels bacteris o fongs; cal utilitzar sistemes cel·lulars. Així doncs, no formaran colònies que es puguin observar macroscopicament, sinó que caldrà recórrer a altres tipus de tècniques per detectar-ne la presència.Només és possible visualitzar-los amb microscòpia electrònica.
Les mostres:
Les millors mostres són les que s'obtenen durant les primeres fases de la malaltia, preferentment dins de les primeres 72 hores, ja que contenen elevades concentracions de virus que encara no han estat reconeguts pels anticossos del sistema immunitari de l'hoste. Transcorreguts 7 dies des de l'inici de la infecció en hostes immuno-competents, normalment ja no val la pena intentar cultius virals i cal recórrer a altres tècniques de diagnòstic.
Estudi directe de la mostra:
Els laboratoris de microbiologia apliquen tècniques de cribratge (screening) amb la principal avantatge de la rapidesa diagnòstica. Aquestes proves de diagnòstic ràpid es basen en la detecció d'antígens i àcids nucleics o en la detecció de la resposta immunitària.
TÈCNIQUES DE CULTIU:
Els cultius cel·lulars es preparen a partir d’un teixit o òrgan i cal diferenciar entre:
Cultiu primari. Es prepara a partir d’un teixit o òrgan. Les cèl·lules mantenen la viabilitat per un temps limitat i no es reprodueixen al cultiu.
Línia primària. Cultiu establert a partir d’un teixit o òrgan que es manté per un temps limitat, però en aquest cas si existeix la reproducció de les cèl·lules al cultiu.
Línia cel·lular contínua. A partir d’un teixit o òrgan, en molts casos d’un tumor, que es manté en cultiu durant un temps il·limitat. Es tracta de cèl·lules immortals.
Cultiu accelerat Shell vial
Els diferents cultius cel·lulars presenten diferent susceptibilitat als diferents virus, ja que existeix una relació específica hoste-virus. Ens funció de les dades clíniques del pacient i del tipus de mostra rebuda al laboratori, s'escull el tipus de cultiu més adequat per inocular el material.
La mostra s'inocula en el tipus de sistema cel·lular escollit i s'incuba a 35-37 ºC durant uns 14 dies, observant el cultiu al microscopi òptic a les 24, 48 i 72 hores, i després dos cops per setmana (no s’observaran els virus, com ja s'ha comentat, sinó els seus efectes sobre les cèl·lules).
Aquesta tècnica millora l’adherència i la penetració del virus a la cèl·lula receptora, permetent la identificació de proteïnes del virus mitjançant anticossos monoclonals específics marcats amb fluoresceïna en 48h. Els cultius cel·lulars que s'utilitzen consisteixen en monocapes de cèl·lules metabòlicament actives, que s’adhereixen a la superfície d’un tub, flascó o cobreobjectes continguts en un Shell vial de fons pla. La mostra es diposita en aquests tubs i es realitza una centrifugació per accelerar l’adherència i la penetració del virus a les cèl·lules.
Font: Apunts de microbiologia de la Joviat.
Tècniques d'identificació:
Es classifiquen en directes o indirectes, segons es pretengui demostrar la presència del virus o d'algun dels seus constituents. Moltes de les tècniques que s'apliquen entren al camp de la immunologia o de la biologia molecular.
Tècniques de microscòpia electrònica.
Permeten visualitzar el virus i estudiar la seva estructura i mida. També existeixen tècniques per quantificar les partícules víriques presents. En anàlisis de rutina només s'apliquen tècniques senzilles de microscòpia electrònica. Altres tècniques més complexes (citoquímica i immuno-histoquímica ultraestructura, immuno-microscopía electrònica, etc.), només s'apliquen en investigació.
Una de les tècniques més utilitzades és la tinció negativa: és col·loca una micro-gota d'una suspensió que contingui el virus sobre una reixeta de microscopi electrònic recoberta d'una pel·lícula i afegir una substància electrodensa, que es dipositarà sobre la superfície i el contorn dels virus, oferint una imatge en negatiu dels virus al microscopi de transmissió. La forma de la càpsida, la presencia o no de coberta externa i d'espícules, o la forma de l'àcid nucleic son característiques observables que permeten tenir una aproximació del tipus de virus present a la mostra.
Detecció en cultius.
Identificació d'una partícula com a virus.
Quan s'obté una partícula amb característiques físiques, ha de satisfer els criteris següents abans que sigui identificada com a partícula viral:
1. La partícula pot obtenir-se només de tres cèl·lules o teixits infectats.
2. Les partícules obtingudes de diverses fonts són idèntiques sense importar l'origen cel·lular en el qual es va cultivar el virus.
3. Les partícules contenen àcids nucleics (DNA o RNA) i la seqüència d'aquests àcids no és la mateixa que la de les cèl·lules hostes, a partir de les quals es van obtenir les partícules.
4. El grau d'activitat infecciosa de la preparació varia directament amb el nombre de partícules presents.
5. La destrucció de la partícula física per mitjans químics o físics s'associa amb pèrdua de l'activitat viral.
6. Certes propietats de les partícules com l'inefectivitat han de ser idèntiques, per exemple, la seva conducta de sedimentació en la ultracentrifugació i corbes d'estabilitat al Ph.
7. Els antisèrums preparats contra el virus infecciós han de produir una reacció amb la partícula característica i viceversa.
8. L'observació directa d'un virus desconegut es pot dur a terme mitjançant estudi amb microscòpia electrònica de la formació d'agregats en una barreja d'antisèrum i amb suspensió de virus.
9. Les partícules són capaços de produir la malaltia característica in vivo (quan aquests experiments siguin factibles).
10. El pas de partícules en cultius de teixits ha d'ocasionar la producció de progènie amb propietats biològiques i antigèniques de virus.
I PEL QUE FA AL NOSTRE ENEMIC...
Imatge de Andy Brunning (creative commons licence)
